ДНК. История генетической революции - Страница 26

Плазмида под электронным микроскопом

Первопроходцем в исследовании плазмид был Стенли Коэн из Стэнфордского университета. Коэн выбрал медицинскую карьеру, поскольку его вдохновил на этот путь школьный учитель биологии. Закончив медицинский университет, он подумывал заняться внутренними болезнями, но забросил эти планы, когда перед ним встал выбор – пойти служить армейским врачом или занять должность в Национальных институтах здравоохранения. Вскоре он осознал, что исследовательская деятельность ему более интересна, чем практическая медицина. Первый серьезный успех ждал его в 1971 году, когда Коэн научился управлять захватом бактериями E. coli плазмид вне пределов клетки. Фактически Стенли Коэн «трансформировал» E. coli подобно тому, как Фред Гриффит сорока годами ранее превратил жизнеспособные пневмококки в нежизнеспособные, «заставив» их поглотить участок ДНК. В опытах Коэна бактерия поглощала плазмиду с генами устойчивости к антибиотикам, и штамм, ранее погибавший от антибиотика, терял восприимчивость к нему. Штамм сохранял устойчивость к антибиотику и в последующих поколениях – копии плазмидной ДНК в целости и сохранности передавались потомкам при делении клеток.

К началу 1970-х годов имелись все составляющие для получения рекомбинантной ДНК. Сначала было нужно разрезать молекулу ДНК при помощи рестриктаз и выделить интересующие нас последовательности (гены), а затем скопировать интересующий нас фрагмент ДНК и вставить плазмиду в бактериальную клетку, как USB-флешку в подготовленный для нее разъем. За этим процессом последует обычное бинарное деление бактерий, и плазмида с выбранным нами фрагментом ДНК будет реплицироваться точно так же, как и собственный генетический материал, унаследованный бактериальной клеткой. Таким образом, после пересадки единственной плазмиды в бактериальную клетку в процессе последующего деления бактерии в огромных количествах будет воспроизводиться выбранная нами последовательность ДНК. Поскольку мы сами способствуем воспроизводству выбранной клетки, то через короткий промежуток времени мы создадим колонию из миллиардов бактериальных особей, а значит, и миллиарды копий интересующего нас фрагмента ДНК. Соответственно, полученная нам колония – это завод по производству ДНК.

Все три операции – вырезание, вставка и копирование – были выполнены в 1972 году в Гонолулу. Это произошло на конференции, посвященной исследованию плазмид. На этой конференции присутствовали Герб Бойер, молодой ученый, недавно получивший пост штатного профессора в Калифорнийском университете в Сан-Франциско, и, что ожидаемо, Стенли Коэн, один из первых исследователей плазмид. Оба они были выходцами с востока США. Бойер происходил из Западной Пенсильвании и в старших классах играл в футбол – был нападающим. Пожалуй, ему очень повезло, что тренер по футболу одновременно был учителем естествознания. Как и Коэн, Бойер являлся представителем нового поколения ученых, воспитанных на идее двойной спирали. Он так увлекался изучением ДНК, что даже назвал своих сиамских котов Уотсон и Крик. Поэтому никто, включая тренера, не удивился, когда по окончании колледжа Бойер решил заняться генетикой бактерий.

Хотя и Коэн, и Бойер в те времена работали на берегах бухты Сан-Франциско, до гавайской конференции они не встречались. Бойер был экспертом по рестриктазам уже тогда, когда о них практически никто еще не слышал; именно он и его коллеги определили последовательность оснований на участке, вырезаемом рестриктазой EcoRI. Вскоре Бойер и Коэн осознали, что в альянсе друг с другом смогут вывести молекулярную биологию на совершенно новый уровень – в мир копирования, вырезанияи вставок. Как-то поздним вечером они зашли в ресторанчик в районе Вайкики и принялись фантазировать о зарождении технологии рекомбинантной ДНК, кратко конспектируя свои идеи прямо на салфетках. Такую форму предвидения будущего окрестили «от солонины к клонированию».

Через несколько месяцев наладилось сотрудничество между лабораториями Бойера (в Сан-Франциско) и Коэна (в 64 километрах к югу от Пало-Альто). Герб Бойер продолжал работать над исследованием рестриктаз, а Стенли Коэн ставил опыты с плазмидами. На их удачу, у Коэна была лаборантка Энни Чанг, которая жила в Сан-Франциско и успешно осуществляла обмен драгоценной информацией о результатах исследований, проходящих в этих лабораториях. На первом этапе ученые решили создать гибрид – рекомбинант, состоящий из двух разных плазмид, каждая из которых была устойчива к конкретному антибиотику. В одной плазмиде имелся ген (участок ДНК), обеспечивавший устойчивость к тетрациклину, а в другой – ген устойчивости к канамицину. (Как вы уже догадываетесь, исходно бактерии с первой плазмидой погибали от канамицина, а бактерии с второй плазмидой – от тетрациклина.) Предполагалось сконструировать единую «суперплазмиду», которая бы обеспечивала устойчивость к обоим антибиотикам.

Сначала при помощи рестриктаз разрезали две неизмененные плазмиды. Затем эти плазмиды смешивались в одной пробирке, куда добавлялся фермент лигаза, которая должна была запустить склеивание обрезанных концевых остатков. Некоторые молекулы в пробирке под действием лигазы просто восстанавливали целостность – то есть склеивались два концевых остатка одной и той же плазмиды. Но иногда лигаза срабатывала так, что в разрезанную плазмиду попадали фрагменты ДНК другой плазмиды – так и получался желаемый гибрид. Когда эта задача была решена, требовалось внедрить все плазмиды в бактерии, и это успешно было проделано с использованием технологий Коэна. Полученные от рекомбинантов колонии выращивались на агаровых пластинах, покрытых одновременно тетрациклином и канамицином. Те плазмиды, которые просто восстановились свою структуру, по-прежнему обеспечивали устойчивость лишь к одному из двух антибиотиков, и, соответственно, бактерии с такими плазмидами не выживали в среде, содержащей два антибиотика. В такой среде могли выжить только бактерии с рекомбинантными плазмидами, сконструированными из двух имевшихся разновидностей ДНК, одна из которых кодировала устойчивость к тетрациклину, а другая – к канамицину.

Герб Бойер и Стенли Коэн – первые в мире генные инженеры

Следующий вызов сложившемуся в обществе укладу заключался в создании гибридной плазмиды с использованием ДНК не бактерий, а иного организма, например человека. В одном из первых успешных экспериментов ген африканских шпорцевых лягушек удалось добавить в плазмиду E. coli и трансплантировать ее в бактерию. Всякий раз при делении клеток в такой бактериальной колонии реплицировался лягушачий фрагмент ДНК. Если не применять сложную молекулярно-биологическую терминологию, а просто описать происходящее, то это выглядит как «клонирование ДНК лягушки»[5]. Как стало известно, ДНК млекопитающих также успешно клонируется. Ретроспективный анализ показал, что в этом нет ничего особенно удивительного: любой фрагмент ДНК – это, в конечном счете, просто ДНК, его химические свойства не изменяются в зависимости от источника. Вскоре стало понятно, что протоколы Коэна и Бойера, описывающие клонирование фрагментов ДНК, применимы к ДНК любого организма.

Таким образом, разворачивался уже второй этап молекулярно-биологической революции. На первом этапе мы стремились описать статус и функционал ДНК в клетке, затем, после получения рекомбинантной ДНК[6], появились реальные инструменты для вмешательства в работу ДНК и манипулирования ею. Был создан плацдарм для стремительного прогресса, а мы примерили на себя роли Творца. Полученные результаты пьянили: открывался огромный потенциал, позволявший глубоко погрузиться в тайны жизни и добиться успеха в борьбе с такими болезнями, как рак. Несмотря на то что работы Коэна и Бойера предоставили нам фантастические научные перспективы, – не открылся ли при этом ящик Пандоры? Не скрывалось ли в молекулярном клонировании какое-то неизвестное зло? Можно ли и далее беззаботно вшивать кусочки человеческой ДНК в E. coli, учитывая, какие огромные колонии этих бактерии обитают в «микробных джунглях» нашего кишечника? Что будет, если в кишечник проникнет видоизмененная бактерия? Короче говоря, можно ли, будучи в здравом уме, заткнуть уши и не слушать скептиков, заявляющих, что на глазах у всего научного мира мы творим бактерий-франкенштейнов?